Aderenza alla dieta senza glutine, sviluppo di una nuova metodica di laboratorio per il monitoraggio delle urine

Lo studio

Cosa si è voluto studiare e perché?

La stretta aderenza ad una dieta senza glutine (DSG) è essenziale per ridurre i sintomi, evitare carenze nutrizionali e migliorare la qualità della vita del paziente con Malattia Celiaca (MC). Tuttavia, secondo diversi rapporti, la trasgressione nella dieta è relativamente frequente (32,6-55,4%) nel paziente celiaco. Una parte della popolazione celiaca (5-10%) non risponde ad una DSG e circa l’1-2% dei pazienti, principalmente adulti, può sviluppare celiachia refrattaria (RCD) nonostante una rigida DSG. Inoltre, non esiste un metodo efficace per escludere la possibilità che i sintomi di RCD non siano dovuti a un’ipersensibilità a tracce di glutine presenti accidentalmente in cibi dichiarati gluten-free (GF) o associate a involontaria ingestione di glutine, spesso utilizzato come additivo alimentare, oppure presente nella filiera di produzione. Da tutto questo emerge la necessità di individuare e quantificare correttamente biomarcatori che consentano il monitoraggio a breve termine della conformità alla DSG. Ad oggi, i metodi disponibili per monitorare l’aderenza alla DSG in pazienti con MC non sono abbastanza sensibili da rilevare trasgressioni alimentari occasionali, che possono comunque causare danni alla mucosa intestinale. In molti casi, l’aderenza ad una DSG è valutata mediante misure soggettive e inaffidabili, come i questionari. 

Alcuni lipidi fenolici, nello specifico l’acido 3,5-diidrossibenzoico (DHBA) e l’acido 3-(3,5-diidrossifenil)-propanoico (DHPPA) principali metaboliti degli Alchilresorcinoli (AR), sono stati proposti come biomarcatori per l’assunzione di grano integrale e raffinato. Livelli elevati di questi lipidi fenolici sono stati rilevati nel siero e nelle urine dei pazienti celiaci, con una sostanziale diminuzione in seguito alla DSG. Pertanto, l’obiettivo principale del progetto proposto è stato quello di convalidare un metodo analitico per la rilevazione simultanea di questi due biomarcatori nelle urine, correlandoli all’aderenza alla DSG (Figura 1).

Figura 1. In questa figura viene riportata una rappresentazione grafica che illustra gli obiettivi del progetto. Lo sviluppo del metodo di analisi con la definizione dei protocolli di purificazione del campione e delle impostazioni strumentali (sinistra). La validazione del metodo analitico precedentemente sviluppato (centro). Valutazione clinica preliminare su un gruppo ristretto di volontari sani (destra).

La tecnica utilizzata per lo sviluppo del progetto è stata la cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (UPLC-MS / MS). Questa tecnologia è caratterizzata da elevata specificità e sensibilità consentendo il rilevamento e la quantizzazione di sostanze a concentrazioni molto basse. Inoltre, è dotata di grande versatilità e praticità permettendo l’analisi di matrici biologiche complesse come le urine.

Quali Risultati e Quali Conclusioni?

In una prima fase del progetto è stato necessario validare il metodo analitico seguendo le più recenti linee guida sulla validazione dei metodi bioanalitici. Le procedure di validazione mirano a verificare che il metodo fornisca effettivamente risultati affidabili, se correttamente eseguito. Queste procedure consentono di valutare l’intervallo di concentrazione in cui i biomarcatori sono presenti nelle urine, le condizioni di applicabilità del metodo e di verificare se le misure che verranno effettuate nelle analisi di routine forniranno una concentrazione dei biomarcatori sufficientemente vicina al valore reale. La validazione consiste nella determinazione di parametri di qualità ben definiti di una procedura analitica: selettività, specificità, limite di rilevabilità (LOD) e limite di quantificazione (LOQ), linearità, intervallo di calibrazione, accuratezza, precisione, recupero, robustezza e stabilità. Il metodo da noi sviluppato si è rivelato sensibile e specifico e ci ha permesso di poter passare alla successiva fase di valutazione preclinica. In questa fase abbiamo analizzato campioni di urina raccolti da tre volontari sani sottoposti a un periodo di dieta priva di glutine (Figura 2). Più precisamente nei primi tre giorni è stata seguita una dieta priva di glutine, il terzo giorno sono stati assunti 100 gr di pane bianco. Successivamente, dopo un ulteriore giorno di dieta priva di glutine, è stata ripristinata una regolare dieta a base di glutine. I livelli di metaboliti sono stati osservati quotidianamente mediante l’analisi delle urine mattutine. Nei campioni analizzati è stato osservato un trend caratteristico dei biomarcatori di interesse in corrispondenza della presenza e/o assenza di glutine nel regime alimentare seguito. Queste evidenze, sebbene siano state ottenute su un numero limitato di analisi, supportano il potenziale utilizzo di DHBA e DHPPA come biomarcatori sensibili per verificare anche modeste assunzioni di glutine.

Quali prospettive e quali benefici per i pazienti?

Il paziente celiaco necessita di metodologie di laboratorio specifiche e sensibili che possano aiutare, mediante il prelievo estemporaneo di un campione di urina, una corretta gestione del regime alimentare adottato e di eventuali ingestioni accidentali che possono avere ripercussioni importanti in termini di salute, con conseguenti ricadute sulla qualità di vita del paziente stesso. La valutazione preliminare sui volontari sani ha mostrato un buon potenziale di questi biomarcatori nell’evidenziare anche piccole variazioni nell’assunzione di glutine. Quantificare i livelli di potenziali marcatori di esposizione al glutine potrebbe rappresentare uno strumento promettente per aiutare i pazienti affetti da MC a tenere sotto controllo la loro dieta e i medici a comprendere le cause di eventuali eventi avversi evitando prelievi invasivi, come la biopsia intestinale, e favorendo così la collaborazione del paziente ed un controllo frequente nel tempo. Ovviamente è opportuno estendere lo studio ad un numero maggiore di pazienti in modo da definire meglio  i tempi di metabolizzazione ed escrezione dei metaboliti e valutare al contempo l’effettiva variabilità intra- ed interindividuale.

Eventuali sviluppi futuri del progetto

Seppur completa nella sua validazione analitica, la metodica sviluppata in LC-MS/MS necessita di una validazione clinica su un maggior numero di soggetti che ne individui la sensibilità e la specificità diagnostiche.. Il metodo si è rivelato in grado di discriminare con successo i livelli di metaboliti nelle urine di soggetti sottoposti a diete diverse con risultati statisticamente significativi. Sarà necessario uno studio clinico, su pazienti celiaci e con opportuni gruppi di controllo di volontari sani sottoposti o meno a dieta priva di glutine, per indagare ulteriormente il potenziale dei biomarcatori in correlazione con l’assunzione di glutine e per definire un possibile livello “soglia”, al di sotto del quale la presenza di biomarcatori può essere considerata in linea con una DSG.

Legenda

Celiachia Refrattaria (RCD):complicanza della MC caratterizzata da una mancata risposta istologica, e quindi clinica, dopo 12 mesi di esclusione del glutine dalla dieta.

Biomarcatore: indicatore biologico correlato con una data malattia o con una risposta a un determinato trattamento o condizione.

Alchilresorcinoli (AR): lipidi fenolici a catena lunga presenti negli strati esterni di grano, segale e orzo.

Metabolita: prodotto (intermedio o finale) del processo del metabolismo. Dopo che una sostanza è stata assimilata dall’organismo, subisce un processo di trasformazione che ha la funzione di rendere la sostanza assunta più facilmente assorbibile o eliminabile.