Caratterizzazione delle microvescicole circolanti nel sangue periferico dei pazienti affetti da celiachia come potenziale strumento prognostico di complicanze correlate alla malattia

Scheda dello Studio

• Numero del Finanziamento (Grant): FC 004/2016
• Titolo: Caratterizzazione delle microvescicole circolanti nel sangue periferico dei pazienti affetti da celiachia come potenziale strumento prognostico di complicanze correlate alla malattia
• Area Scientifica: Biologia
• Durata: Progetto Triennale
• Ricercatore Titolare: Dott.ssa Giuseppina Bologna, Dipartimento di Medicina e Scienze dell’Invecchiamento, Centro di Studi e Tecnologie Avanzate (C.A.S.T.), Università “G. d’Annunzio”, Cheti-Pescara
• Tutor (Capo Laboratorio): Professor Sebastiano Miscia, Dipartimento di Medicina e Scienze dell’Invecchiamento, Centro di Studi e Tecnologie Avanzate (C.A.S.T.), Università “G. d’Annunzio”, Cheti-Pescara
• Collaborazioni: Prof. Matteo Neri, Dipartimento di Medicina e Scienze dell’Invecchiamento, Università “G. d’Annunzio”, Cheti-Pescara ; Unità di Endoscopia Digestiva e Gastroenterologia, P.O. “Santa Annunziata”, ASL2 Abruzzo

Pubblicazioni originate dal Grant:

• Clemente E, Efthymakis K, Carletti E, Capone V, Sperduti S, Bologna G, Marchisio M, Di Nicola M, Neri M, Sallese M. An explorative study identifies miRNA signatures for the diagnosis of non-celiac wheat sensitivity. PLoS One. 2019 Dec 13;14(12):e0226478. doi: 10.1371/journal.pone.0226478. Erratum in: PLoS One. 2020 Mar 27;15(3):e0231273. PMID: 31834915; PMCID: PMC6910677. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31834915/
• Simeone P, Celia C, Bologna G, Ercolino E, Pierdomenico L, Cilurzo F, Grande R, Diomede F, Vespa S, Canonico B, Guescini M, Stocchi V, Lotti LV, Guagnano MT, Stellin L, Papa S, Trubiani O, Marchisio M, Miscia S, Lanuti P. Diameters and Fluorescence Calibration for Extracellular Vesicle Analyses by Flow Cytometry. Int J Mol Sci. 2020 Oct 23;21(21):7885. doi: 10.3390/ijms21217885. PMID: 33114229; PMCID: PMC7660682. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33114229/

• Marchisio M, Simeone P, Bologna G, Ercolino E, Pierdomenico L, Pieragostino D, Ventrella A, Antonini F, Del Zotto G, Vergara D, Celia C, Di Marzio L, Del Boccio P, Fontana A, Bosco D, Miscia S, Lanuti P. Flow Cytometry Analysis of Circulating Extracellular Vesicle Subtypes from Fresh Peripheral Blood Samples. Int J Mol Sci. 2020 Dec 23;22(1):48. doi: 10.3390/ijms22010048. PMID: 33374539; PMCID: PMC7793062. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33374539/

LO STUDIO

Cosa si è voluto studiare e perché?

Il progetto si proponeva di studiare una tipologia di biomarcatori circolanti, detti vescicole extracellulari (EV), sia per monitorare l’efficacia della dieta, sia per prevedere eventuali complicanze nei pazienti celiaci.

Le vescicole extracellulari sono delle strutture di derivazione cellulare che circolano nel sangue e in altri fluidi biologici (come urine e lacrime), che si riversano nei fluidi biologici stessi veicolando le molecole derivanti cellule che le hanno generate. Rappresentano, pertanto, una fonte potenzialmente utile per la biopsia liquida e la terapia personalizzata, visto che riflettono esattamente lo stato di salute o di malattia dell’individuo in numerosi contesti patologici (FIGURA 1). È stato recentemente dimostrato che la variazione dei livelli circolanti di vescicole extracellulari può essere indice di malattia. Per esempio, si sa che condizioni cliniche, come l’insulino-resistenza, l’aterosclerosi e la malattia infiammatoria intestinale (IBD), sono caratterizzate dall’aumento dei livelli di vescicole extracellulari nel sangue. Poiché mai, prima dello studio proposto con il presente progetto, era stato studiato il coinvolgimento delle vescicole extracellulari circolanti nella malattia celiaca, abbiamo caratterizzato le vescicole extracellulari di pazienti celiaci, analizzandole da varie prospettive.

FIGURA 1: Immagine descrittiva della formazione delle Vescicole Extracellulari derivanti da una cellula parentale

La Metodologia

Tutti i soggetti coinvolti nello studio sono stati arruolati dall’Unità Operativa di Endoscopia digestiva e Gastroenterologia del P.O. “SS. Annunziata” (Chieti). Le vescicole extracellulari circolanti sono state identificate in campioni di sangue mediante un metodo particolarmente innovativo, recentemente brevettato dalla Dott.ssa Giuseppina Bologna in collaborazione con il suo gruppo di ricerca e applicato per la prima volta al mondo su una casistica di pazienti celiaci. Questa metodica è basata sull’applicazione di una tecnologia particolarmente innovativa, detta citometria a flusso (FIGURA 2). Questo metodo ha permesso di identificare ed enumerare vescicole extracellulari provenienti da diversi comparti cellulari coinvolti nella malattia celiaca. Sono stati reclutati 22 pazienti adulti celiaci alla diagnosi, 22 pazienti celiaci in dieta (GFD) e 22 controlli sani, sovrapponibili per genere ed età ai pazienti. Mediante specifici marcatori di membrana è stato possibile identificare le vescicole circolanti generati da diverse tipologie cellulari potenzialmente coinvolte nella patogenesi della malattia.

FIGURA 2: Schema generale delle caratteristiche di un citofluorimetro

Quali Risultati e quali conclusioni?

I dati ottenuti (oggetto di una pubblicazione che è attualmente in revisione presso una prestigiosa rivista internazionale) mostrano che le vescicole extracellulari che derivano dalle cellule epiteliali (presumibilmente associate alla presenza del danno a carico del sistema digerente) sono significativamente più abbondanti nel sangue periferico dei pazienti celiaci, rispetto ai controlli sani. I nostri risultati evidenziano, inoltre, che le vescicole cellulari di origine epiteliale correlano con il grado di atrofia dei villi intestinali (e dunque con il danno intestinale) e con la presenza di infiltrati linfocitari nella mucosa intestinale.

Rispetto alle concentrazioni circolanti di vescicole extracellulari di origine epiteliale, inoltre, i pazienti celiaci sottoposti al regime dietetico non presentano differenze rispetto ai controlli sani. Ciò vuol dire che il rilascio di vescicole extracellulari di origine epiteliale riflette perifericamente una potenziale riduzione del danno epiteliale associato ad una dieta gluen-free.

Si registra, invece, un incremento dei livelli di vescicole leucocitarie (la cui presenza è generalmente associata ad infiammazione) in entrambe le categorie di pazienti celiaci analizzati, indipendentemente dall’esposizione al glutine, probabilmente associato allo sviluppo di complicanze sia autoimmuni che immuno-mediate tipiche della malattia celiaca.

Complessivamente, questi dati suggeriscono una correlazione specifica tra rilascio di vescicole di extracellulari e danno intestinale e disregolazione del sistema immunitario nei pazienti celiaci.

Quali prospettive e quali benefici per I pazienti celiaci?

La celiachia rappresenta un paradigma unico di malattia. È caratterizzata da enteropatia indotta dal glutine, in cui la rimozione dello stesso è generalmente seguita dalla remissione di malattia, come è dimostrato dalla regressione dell’atrofia dopo l’esclusione del glutine dalla dieta. La celiachia è anche associata a complicanze sia autoimmuni che immuno-mediate, il cui sviluppo è spesso indipendente dall’attività, dalla gravità o dalla risposta al trattamento. I nostri dati indicano una potenziale rilevante implicazione delle vescicole extracellulari di origine epiteliale e leucocitaria nella patogenesi della malattia, sia in fase acuta che cronica.

 Eventuali sviluppi futuri del progetto:

Partendo da queste evidenze, consolideremo i dati ottenuti nell’ambito di questo progetto per meglio chiarire il potenziale ruolo delle vescicole extracellulari nella patogenesi della celiachia e per meglio caratterizzarne la funzione di biomarcatori innovativi diagnostici e prognostici di complicanze a lungo termine.

Legenda:

EVs: Le vescicole extracellulari originano attraverso meccanismi diversi da cellule “genitrici” a seguito di una serie di stimoli diversi.

Citometria a flusso: La citofluorimetria o citometria a flusso è una tecnica di misurazione multiparametrica dellecaratteristiche fisiche e/o chimiche di campioni di cellule e/o vescicole extracellulari trascinate all’interno di un sistema fluidico; attraverso un sistema ottico specifico, il citometro a flusso è in grado di studiare ogni singola cellula presente nel campione, sia dal punto di vista fisico che del rispettivo fenotipo.