Funzione immunomodulatoria dei linfociti T γδ+ intraepiteliali nella patologia celiaca; risposta immune alla gliadina in vivo e in vitro

Lo studio

Cosa si è voluto studiare e perché?

La malattia celiaca (MC) è un‘enteropatiai mmunomediata che si manifesta nei soggetti geneticamente predisposti a seguito dell’ingestione del glutine.L’enteropatia è caratterizzata da atrofia dei villi intestinali, iperplasia delle cripte e linfocitosi intraepiteliale.

In particolare, tra le diverse sottopopolazioni linfocitarie che invadono l’epitelio, i linfociti T intraepiteliali (IELs) γδ+ rappresentano un elemento distintivo della malattia.

Nei pazienti  celiaci a dieta senza glutine, il numero dei IELs con TCR αβ+ diminuisce rapidamente, mentre quello dei IELs  TCR γδ+ resta aumentato.

Nonostante l’aumentata frequenza in vivo e l’attività soppressiva dimostrata in vitro, mediata dalla produzione di TGF-β, i IELs γδ+ non riescono a controllare lo stato infiammatorio che interessa la mucosa intestinale dei celiaci attivi, suggerendo un difetto nell’attivazione dei meccanismi regolatori.

Recentemente nella MC è stato dimostrato che l’interleuchina (IL)-15, aumentata nella mucosa intestinale, possiede una azione inibente verso i linfociti T con attività regolatoria (Treg).

Nel complesso, il ruolo specifico degli IELs γδ+ nella mucosa dei pazienti celiaci attivi non è ancora del tutto chiaro.

Tra le tecniche utilizzate per analizzare la produzione di citochine da parte di una specifica popolazione cellulare, la micro dissezione a cattura laser (LCM) ha permesso un’analisi molecolare specifica delle singole sottopopolazioni cellulari nei tessuti, evitando la contaminazione da parte delle cellule circostanti.

Lo studio si è proposto di analizzare il pattern di citochine prodotte nel corso della risposta immunitaria da parte dei IELs γδ+ isolati dalla mucosa intestinale di pazienti celiaci con lesione di grado Marsh II e III , mediante la tecnica della  immuno-LCM.

L’obiettivo della studio è stato quello di mettere in luce il potenziale immunomodulatorio dei IELs ʏδ+, fornendo un possibile aiuto nell’identificazione di strategie terapeutiche alternative per i pazienti celiaci.

Inoltre, utilizzando il modello sperimentale della coltura d’organo intestinale di pazienti celiaci in fase attiva di malattia,è stato valutato l’effetto della neutralizzazione dell’attività biologica dell’IL15 rispetto alla produzione di citochine pro- e anti- infiammatorie .

La Metodologia

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico Campania Nord (n°CECN/809). Previa raccolta del consenso informato, biopsie digiunali sono state ottenute da 20 pazienti celiaci (10 celiaci attivi con lesione MarshIII, 10con lesione Marsh II) .

I linfociti IELs γδ+ sono stati isolati mediante immuno-LCM da sezioni criostati che seriali speculari ottenute dalle biopsie e da queste cellule, mediante RT-qPCR, è stata analizzata la produzione di citochine antinfiammatorie (IL-10 e TGF-β) e pro-infiammatorie (IL-17, IFN-γ e TNF-α).

Nella seconda parte dello studio, biopsie ottenute da 9 pazienti celiaci attivi sono state messe in coltura con e senza un anticorpo neutralizzante l’attività biologica dell’IL15, valutando  mediante RT-qPCR,  gli effetti  rispetto alla produzione di IFN-γ e  TGF-β.

Quali Risultati e Quali Conclusioni?

Nei pazienti celiaci attivi abbiamo verificato che persiste la produzione di citochine anti-infiammatorie da parte dei IELs γδ+. Infatti, nei pazienti con Marsh II, iIELs γδ+ producono una maggiore quantità di IL-10 rispetto ai IELs γδ+ isolati da pazienti con lesione intestinale Marsh III. Contrariamente, il TGF-β viene prodotto dai IELs γδ+ sia nei Marsh II che nei Marsh III.

Inoltre, nei Marsh III c’è una forte risposta pro-infiammatoria di tipo Th-1/Th-17 da parte dei IELs γδ+, con aumentata espressione di IFN-γ, IL-17 e TNF-α, rispetto ai Marsh II.

Questi dati suggeriscono:

– che nei celiaci attivi la produzione di citochine anti-infiammatorie  da parte dei IELs γδ+ persiste;

– la risposta di tipo Th1/Th17 aumenta con l’aumentare dell’ infiammazione;

Pertanto,  i γδ+ IELs isolati in pazienti con MC attiva, producono citochine con effetti contrastanti sul processo infiammatorio, che fanno ipotizzare una certa plasticità funzionale.

(vd. Figura 1).

Figura 1 – I γδ+ IELs nella MC attiva producono citochine con effetti contrastanti sul processo infiammatorio, che fanno ipotizzare  una certa plasticità funzionale. 

Un certo tipo di plasticità funzionale era già stato precedentemente dimostrato per cellule T CD4 + TCR αβ+ gliadina-specifiche isolate nella lamina propria della mucosa intestinale di pazienti con CD attiva, secernenti contemporaneamente IL-17 e TGF-β , con azione rispettivamente pro- e anti-infiammatoria.

Sono necessarie ulteriori indagini per meglio definire i meccanismi specifici che definiscono il ruolo dei IELs γδ+ nella patogenesi della MC, soprattutto per capire se è la stessa popolazione di cellule che subisce uno switch funzionale oppure se sono presenti sottopopolazioni cellulari con diversa funzionalità che sono più o meno indotte in relazione allo stato infiammatorio in cui si trovano.

I risultati ottenuti nella seconda parte dello studio, mostrano invece come la neutralizzazione dell’attività biologica dell’IL15 determina, nella mucosa intestinale dei pazienti celiaci attivi, un aumento della produzione del TGF-β e una riduzione della secrezione di IFN-γ.

Questi risultati confermano che l’IL15, presente in grande quantità nella mucosa infiammata dei pazienti celiaci, ha una azione inibente sulle cellule deputate alla produzione del TGF-β. 

Quali prospettive e quali benefici per i pazienti celiaci?

I risultati di questo studio migliorano la conoscenza del ruolo dei linfociti T IELs ʏδ+ in soggetti affetti da MC in fase attiva di malattia , in particolare nei diversi stadi di lesione istologica (Marsh II e III).

Tuttavia, sono necessarie indagini più approfondite per valutare meglio la funzione effettrice di queste cellule e meglio caratterizzare gli elementi che ne influenzano la probabile plasticità funzionale.

Sulla base di una comprovata plasticità funzionale, si potrebbe pensare di dare inizio all’elaborazione di strategie immunoterapeutiche basate sull’espansione dei linfociti T ʏδ+ IELs con funzione immunoregolatoria piuttosto che pro-infiammatoria, fornendo  possibili alternative terapeutiche alla dieta senza glutine.

Eventuali sviluppi futuri del progetto

I meccanismi patogenici alla base della MC sono molto complessi e tuttora non bene noti.

Una caratterizzazione più approfondita delle cellule T IELs γδ+ nell’uomo, potrebbe consentire, eventualmente fossero presenti sottopopolazioni con funzioni diverse, la manipolazione di un sottoinsieme specifico al fine di orientarlo verso una risposta fisiologica piuttosto che patologica.

Legenda

Linfociti T gamma delta: Le cellule T gamma delta (cellule T γδ) sono cellule T che hanno un caratteristico recettore delle cellule T (TCR) , costituito da una catena γ (gamma) e una catena δ (delta). Questo gruppo di cellule T è di solito poco comune rispetto ad altre sottopopolazioni linfocitarie  , ma ha la più alta abbondanza nella mucosa intestinale, specialmente tra i linfociti che infiltrano l’epitelio , ossia la parte più esterna della mucosa intestinale , noti come linfociti intraepiteliali (IEL). Il ruolo specifico di queste cellule e le molecole che ne determinano l’attivazione sono ancora in gran parte sconosciute.

Citochine: Le citochine sono molecole proteiche prodotte da vari tipi di cellule e secrete in risposta a uno stimolo. Sono in grado di indurre attività come crescita, differenziazione e morte. Solitamente hanno azione localizzata ma, in alcuni casi, il loro effetto può estendersi a livello sistemico. Hanno un’ emivitamedia di pochi minuti.

Laser capturemicrodissection: La microdissezione a cattura laser (LCM), chiamata anche microdissezione, microdissezione laser (LMD) o microdissezione assistita da laser (LMD o LAM), è un metodo per isolare specifiche cellule di interesse da regioni microscopiche di tessuti / cellule / organismi (dissezione su scala microscopica)  con l’aiuto di un laser, evitando la contaminazione da parte delle cellule circostanti.

RT-qPCR: La Real time PCR – anche nota come Quantitative PCR, abbreviato qPCR – è un metodo che simultaneamente amplifica  e quantifica il DNA. Il DNA è amplificato da reazioni a catena della DNA-polimerasi. Dopo ogni turno di amplificazione, il DNA è quantificato. I metodi comuni di quantificazione includono l’uso delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA doppio-filamento (ds) e gli oligonucleotidi modificati del DNA (denominati sonde) che sono fluorescenti una volta ibridati con un DNA. Spesso è utilizzata per misurare l’espressione relativa di un gene ad un tempo particolare, o in una cellula o in un tipo particolare di tessuto.