Meccanismi di regolazione dei geni candidati nella malattia celiaca

Lo studio

Cosa si è voluto studiare e perché?

Nell’ambito della genetica della malattia celiaca (MC) i soli fattori genetici identificati fino ad oggi non giustificano l’aumentata incidenza riscontrata negli ultimi decenni. È ormai accertato  che nella patogenesi della malattia giocano un ruolo importante i fattori ambientali , pertanto  i meccanismi epigenetici possono rappresentare il punto di incontro tra genetica e ambiente.

Almeno tre sistemi sono considerati elementi chiave per avviare e sostenere il cambiamento epigenetico: la metilazione del DNA; le modifiche della cromatina; gli RNA non codificanti. Questi sistemi lavorano spesso in maniera cooperativa, agendo insieme per accendere o spegnere geni specifici in un determinato momento o tipo cellulare.

ll genoma contiene numerosi geni non codificanti che sono trascritti in RNA non codificanti. Alcuni esemplari di questa classe di RNA sono stati identificati come importanti regolatori epigenetici. In particolare, alcuni lunghi RNA non codificanti (lncRNA) che hanno una dimensione maggiore di 200 nucleotidi e non hanno la capacità di codificare proteine

Ciò premesso, gli obiettivi del nostro studio sono stati i seguenti: (1)analizzare l’espressione molecolare di  SNPs (polimorfismi a singolo nucleotide)  associati alla MC, localizzati all’interno di regioni geniche codificanti lncRNA  di cellule intestinali epiteliali e non epiteliali di soggetti celiaci e controlli (2)valutare la localizzazione e la quantizzazione di lncRNA all’interno di sezioni di biopsie intestinali paraffinate di soggetti celiaci,attivi e a dieta senza glutine, di soggetti potenziali e controlli , combinando tecniche di ibridazione in situ (ISH) e di immunoistochimica (IHC).(3)Caratterizzare mediante colorazioni immunoistochimiche le popolazioni cellulari in cui i lncRNA risultano eventualmente espressi.(4) Mediante analisi bioinformatica identificare gli eventuali geni bersaglio regolati dai singoli lncRNA e valutarne l’espressione mediante tecniche di biologia molecolare su tutta la nostra popolazione.

La Metodologia

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell’Università Federico II di Napoli. Per la localizzazione e la quantizzazione dei lncRNAs sono state selezionate biopsie intestinali  in paraffina di  27 celiaci ,10 potenziali, 5 celiaci a dieta senza glutine (GFD) e 22 controlli. È stata utilizzata un’ibridazione in situ (RnaScope) che consente la visualizzazione e la quantizzazione di singole molecole attraverso l’amplificazione simultanea del segnale. L’analisi di espressione molecolare e la genotipizzazione sono state effettuate mediante Real-timePCR,un metodo che simultaneamente amplifica (reazione a catena della polimerasi o PCR) e quantifica il DNA. Un sistema automatizzato (BOND)) ha consentito la colorazione immunoistochimica anti-CD3. Per le analisi statistiche è stato utilizzato il programma  SPSS.

Quali Risultati e Quali Conclusioni?

Nella fase preliminare dello studio è stata sperimentata un’analisi differenziale dell’espressione genica nella mucosa intestinale dei pazienti celiaci, a livello del compartimento epiteliale e  della lamina propria. Sono stati isolati 7SNP associati alla MC,localizzati in regioni geniche codificanti lncRNA. Tra questi solo linc01882 è risultato differenzialmente espresso nei celiaci rispetto ai controlli e maggiormente espresso nella lamina propria dei celiaci. Linc01882 è nel cromosoma18 di PTPN2 (proteina tirosina fosfatasi non-recettore tipo2), un gene associato alla MC,coinvolto nell’attivazione delle celluleT e nella regolazione delle citochine.

Per analizzare il coinvolgimento di linc01882 e dei geni bersaglio nella MC abbiamo valutato la sua espressione e localizzazione.Rispetto ai dati preliminari,non c’è differenza di espressione tra i due compartimenti, epitelio e lamina propria.Aumentando il numero di casi, l’espressione del lncRNA nei celiaci è elevata rispetto ai controlli anche in epitelio.Ipotizzando che i segnali fossero dovuti alla presenza di linfocitiT intraepiteliali,abbiamo eseguito una doppia colorazione con anticorpi anti-CD3.I dati confermano che l’espressione di linc01882 è correlata alla presenza di linfociti T,che svolgono un ruolo cruciale nel controllo delle risposte autoimmune.Livelli simili di espressione nei celiaci con diverso grado di atrofia della mucosa,suggeriscono  che la sua espressione è poco influenzata dal grado di infiammazione.L’ipotesi è avvalorata dall’espressione nei celiaci GFD, che è paragonabile a quella dei celiaci attivi facendo presupporre che l’espressione di questo lncRNA nei celiaci non è legata all’ infiammazione,ma potrebbe essere costitutiva.

Nell’analisi di espressione dei geni bersaglio,PTPN2 e MAP2K4 mostrano un livello di espressione inferiore nei celiaci rispetto ai controlli;ZEB1 mostra stessi livelli di espressione tra le popolazioni.MAP2K4 è un componente della cascata delle chinasi che media le risposte cellulari ai segnali delle citochine e ZEB1 codifica per un fattore di trascrizione che reprime l’espressione IL2 nei linfociti T. Altra evidenza che emerge è che la variazioni genetica (SNP rs12971201) all’interno di PTPN2 è coinvolta nella regolazione di linc01882 nella MC.Occorrono ulteriori studi per valutare il ruolo esatto di linc01882 nei linfociti T nello sviluppo di MC.

Quali prospettive e quali benefici per i pazienti celiaci?

Lo studio ha contribuito a dimostrare che all’insorgenza della malattia celiaca, insieme ad una ormai nota componente genetica, concorrano diversi meccanismi sia ambientali che modificatori quali l’epigenetica,e che l’istaurarsi del “fenotipo celiaco” dipende dalla regolazione di diversi meccanismi molecolari e cellulari. Non vi sono promesse immediate di nuove terapie, ma il progresso nella conoscenza dei meccanismi di regolazione dei geni , coinvolti nella risposta al glutine solo nei soggetti celiaci e non in altri, è la premessa fondamentale per migliorare significativamente la possibilità di modulare l’anomala risposta immune al glutine. Decifrare completamente i meccanismi con cui linc01882 contribuisce all’ attivazione delle cellule T potrebbe fare luce sui meccanismi di regolazione dell’ espressione genica e potrebbe anche rivelare bersagli precedentemente non identificati da utilizzare nella diagnosi o trattamento di malattie autoimmuni come la MC.

Eventuali sviluppi futuri del progetto

Per quanto riguarda eventuali studi futuri sarebbe interessante esplorare l’espressione di linc01882 nella progressione della malattia celiaca a livello delle cellule del sangue periferico. Si potrebbe indagare quale potrebbe essere il ruolo cruciale nella patogenesi della malattia celiaca silenziando linc01882 nelle PBMC (cellule mononucleate del sange periferico) messe in coltura e nelle colture d’organo dei pazienti celiaci.

Legenda

L’epigenetica è la branca della genetica che studia le modificazioni ereditabili che alterano la funzionalità del gene, senza alterare la sequenza nucleotidica del DNA. Mentre il profilo genetico rimane stabile durante la vita dell’individuo, il profilo epigenetico è più facilmente e più rapidamente influenzato dai fattori ambientali (dieta, stress, agenti chimici, farmaci).

L’RNA non codificante in biologia molecolare è un trascritto genico che non va incontro a traduzione. Ciò significa che il gene che codifica per tale RNA non codifica per una proteina ma semplicemente per una molecola di RNA (e quindi non un mRNA, perché altrimenti andrebbe incontro a traduzione).

SNP.Un polimorfismo a singolo nucleotide  è un polimorfismo, cioè una variazione, del materiale genico a carico di un unico nucleotide, tale per cui l’allele polimorfico risulta presente nella popolazione in una proporzione superiore all’1%. 

I linfociti T sono una classe di  globuli bianchi, appartenenti alla famiglia dei linfociti. I globuli bianchi sono cellule del sangue la cui funzione è quella di attuare meccanismi di difesa contro microrganismi patogeni, cellule neoplastiche o corpi estranei penetrati nell’organismo e antigeni di vario genere (ossia sostanze estranee all’organismo che attivano la risposta del sistema immunitario).

CD3(cluster di differenzazione).È un co-recettore dei linfociti T. IL CD3 in quanto necessario all’attivazione dei linfociti T, è spesso bersaglio degli anticorpi monoclonali nelle terapie immunosuppressive per le malattie autoimmuni.

IL2(Interleuchina 2) È una citochina  necessaria al differenziamento e all’espansione dei linfociti T. 

Citochine.Sono molecole proteiche prodotte da vari tipi di cellule e secrete nel mezzo circostante, di solito in risposta ad uno stimolo, e inducono nuove attività come crescita, differenziazione e morte.

L’ibridazione in situ (ISH) è un importante strumento della biologia molecolare, essendo applicata all’isolamento e alla quantificazione di specifiche sequenze di acidi nucleici in strutture cellulari , allo studio della loro localizzazione intracellulare, espressione e regolazione. È anche utilizzata nello studio della organizzazione ed evoluzione dei genomi e per definire la posizione o la funzionalità dei geni che ne fanno parte. L’ISH si basa sulla formazione di coppie di basi stabili (ibrido) tra la sonda nucleotidica a DNA o RNA marcata con un tracciante di diversa natura e la sequenza nucleotidica bersaglio che si vuole studiare.