Un Test genetico per la diagnosi della sensibilità al glutine non celiaca

• Numero del Finanziamento (Grant): FC 046/2013 Investigator Grant
• Titolo: Test genetico per la diagnosi della sensibilità al glutine non celiaca
• Area Scientifica: Gluten Sensitivity, Genetica
• Ricercatore Titolare: Michele Sallese, Dipartimento di Scienze Mediche Orali e Biotecnologiche, Università Degli Studi G. D’annunzio Chieti-Pescara, Chieti Italia
• Collaborazioni: Prof Matteo Neri Dipartimento di Medicina e Scienze dell’ Invecchiamento Università Degli Studi G. D’annunzio Chieti-Pescara, Chieti Italia
• Durata: Progetto Triennale

Pubblicazioni su riviste internazionali derivanti dal Progetto:

• Efthymakis, K.; Clemente, E.; Marchioni, M.; Di Nicola, M.; Neri, M.; Sallese, M., An Exploratory Gene Expression Study of the Intestinal Mucosa of Patients with Non-Celiac Wheat Sensitivity. Int J Mol Sci 2020, 21 (6). https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32183058/
• Clemente, E.; Efthymakis, K.; Carletti, E.; Capone, V.; Sperduti, S.; Bologna, G.; Marchisio, M.; Di Nicola, M.; Neri, M.; Sallese, M., An explorative study identifies miRNA signatures for the diagnosis of non-celiac wheat sensitivity. PLoS One 2019, 14 (12), e0226478. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31834915/

Lo Studio:

Cosa si è voluto studiare e perché?

La sensibilità al glutine non celiaca (NCGS) è una sindrome dipendente dall’ingestione di glutine con sintomi sia intestinali che generalizzati. I segni clinici della NCGS includono gonfiore, dolore addominale, stanchezza, mente annebbiata, intorpidimento degli arti, dermatite, dolori articolari e muscolari. Questi sintomi sono simili a quelli della celiachia e di altri disturbi legati al consumo/contatto con il frumento. Data la mancanza di biomarcatori specifici per la NCGS, oggi l’approccio diagnostico prevede l’esclusione di patologie confondenti e la valutazione della sintomatologia dopo somministrazione di una dieta priva di glutine. Più in generale, ad oggi sappiamo poco dei fattori che promuovono la NCGS, della possibile predisposizione genetica e dei meccanismi patologici coinvolti.

Studi precedenti volti ad identificare le caratteristiche dell’NCGS hanno scoperto,  nell’intestino di questi pazienti, cambiamenti nell’espressione di alcuni geni e/o proteine tra le quali ricordiamo Foxp3, Toll-like recettore 2, claudin-4 e IFNγ. Inoltre, nel plasma sono stati documentati livelli aumentati della proteina che lega l’LPS e di una proteina che lega gli acidi grassi.

Poiché nell’NCGS le alterazioni molecolari e cellulari sono poco evidenti, almeno usando gli approcci classici, abbiamo ipotizzato che piccole alterazioni a carico di diversi geni potessero causare il disagio intestinale riportato da questi pazienti. Sulla base di questa ipotesi abbiamo proposto di valutare le differenze nell’espressione di miRNA e di geni in pazienti affetti da NCGS e controlli. Abbiamo cercato di usare queste informazioni per fare luce sul meccanismo molecolare che regola questo disturbo e di identificare possibili biomarcatori che potrebbero essere utili per la diagnosi.

La metodologia

Pazienti sintomatici non affetti da celiachia sono stati sottoposti a dieta priva di glutine e successivamente in quelli che non avevano più sintomi è stato reintrodotto il glutine, la ricomparsa dei sintomi portava alla diagnosi di NCGS. Come controlli sono stati inclusi pazienti con sintomi di dispepsia e pazienti affetti da celiachia diagnosticata con protocolli standard. L’espressione di miRNA selezionati è stata valutata mediante PCR, mentre l’espressione genica è stata valutata mediante analisi di microarray in RNA estratti dalle biopsie intestinali dei pazienti.

Quali risultati e quali conclusioni?

I meccanismi patogenetici di NCGS sono ancora poco conosciuti e la diagnosi è esclusivamente clinica. In questo studio abbiamo effettuato uno screening di miRNA selezionati e un’analisi dell’espressione genica ad ampio spettro su RNA estratto dalla mucosa intestinale di pazienti NCGS e controlli. Abbiamo identificato 6 miRNA la cui espressione è più elevata nella mucosa intestinale dei pazienti affetti da NCGS rispetto ai pazienti controllo affetti da sintomi dispeptici e da celiachia. Abbiamo anche rilevato che la mucosa intestinale di pazienti affetti da NCGS presenta circa 300 geni con espressione alterata, la maggior parte dei quali rappresenta un RNA non codificante per alcuna proteina ma potrebbe avere funzioni regolatorie. Attraverso un’analisi statistica avanzata abbiamo poi raggruppato le misurazioni in un’unica variabile capace di riassumere le caratteristiche del paziente affetto da NCGS e quindi identificare i pazienti affetti da NCGS. Inoltre, abbiamo definito una classifica di geni la cui espressione è maggiormente rappresentativa dalla condizione di NCGS. Questi risultati suggeriscono che la profilazione dell’espressione genica potrebbe essere utile nella diagnosi positiva e/o nell’esclusione dell’NCGS nei soggetti sintomatici. L’analisi della funzione dei geni deregolati ha suggerito che l’NCGS potrebbe originare da una risposta immunitaria patologica, soprattutto di quella innata. Infine, un particolare tipo di RNA definito “non codificante” potrebbe giocare un ruolo importante in questa patologia.

Quali prospettive e quali benefici per i pazienti celiaci?

Questo studio ha fornito la prima prova che i pazienti NCGS possono essere riconosciuti da profili genetici. La rilevanza della nostra scoperta è sottolineata dall’attuale mancanza di biomarcatori e di test di laboratorio utili a convalidare la diagnosi di NCGS. L’analisi di profili di espressione di miRNA e/o espressione genica, combinati con le informazioni cliniche e l’esclusione di altre patologie, potrebbero rappresentare un futuro approccio per la diagnosi di questa sindrome. Tuttavia, per introdurre questi marcatori genetici nella clinica, è necessario che i nostri risultati siano convalidati su una popolazione più ampia di pazienti.

Eventuali sviluppi futuri del Progetto

Questo studio indica che i pazienti affetti da NCGS hanno specifiche caratteristiche molecolari che si potrebbero sfruttare per convalidare la diagnosi clinica. Per consolidare la nostra scoperta sarebbe importante riprodurre questi risultati anche in altri laboratori e soprattutto su un gruppo sufficientemente ampio di pazienti. Inoltre, sarebbe importante studiare il ruolo che hanno i geni con espressione alterata nello sviluppo della NCGS. Ottenere questa informazione permetterebbe di capire a fondo il meccanismo patogenetico della NCGS e quindi di agire per prevenire o trattare nella maniera migliore i pazienti. Ad esempio, oggi non sappiamo se i pazienti affetti da NCGS perseverando nell’assunzione di glutine abbiamo solo una sintomatologia fastidiosa oppure a se lungo andare potrebbero avere conseguenze gravi.

Legenda

Biomarcatore: In medicina, un biomarcatore, è una molecola i cui livelli sono indicativi della presenza di una particolare condizione clinica e/o risposta ad un trattamento.

LPS: Il lipopolisaccaride è uno dei componenti della membrana di una classe di batteri denominati gram-negativi. L’LPS causa infiammazione e attivazione del nostro sistema immunitario.

Foxp3, Toll-like recettore 2, e IFNγ: Questi sono geni che partecipano alla riposta immunitaria contro agenti patogeni.

RNA: L’acido ribonucleico o RNA è una sostanza che trasporta l’informazione genetica del DNA al fine di generare le proteine o controllare importanti funzioni cellulari.

Gene: Il gene è una specifica porzione di DNA dove è contenuta l’informazione necessaria a produrre un proteina o un RNA regolatorio. Spesso gli RNA regolatori, che non servono per codificare le proteine (non-coding RNA) sono classificati in base alla loro lunghezza in piccoli RNA e lunghi RNA.

Espressione genica: Per espressione genica si intende la quantità di RNA prodotto da un gene specifico.

miRNA: I miRNA sono micro-RNA che servono a regolare l’espressione di altri geni.

PCR: La PCR o reazione polimerasica a catena è una metodica che permette di identificare, amplificare e quantificare un porzione di DNA o RNA. È molto utilizzata per misurare i livelli di espressione genica.

Microarray: Il microarray conosciuto anche come gene chip è costituito da un vetrino dove sono state immobilizzate migliaia di frammenti di DNA capaci di legare in maniera specifica e quantitativa DNA corrispondenti detti complementari. Solitamente la metodica basata sul microarray è utilizzata per misurare i livelli di espressione di tutti i geni contenuti in un tessuto.

Mucosa intestinale: La mucosa intestinale è la parte più interna, cioè il lato luminare a contatto con il cibo, del nostro intestino. È costituita da muco, cellule epiteliali, tessuto, tessuto muscolare liscio e cellule immunitarie.